腺相關病毒（AAV）是基因治療中強大的遞送載體[1]。然而，在AAV組裝過程中，其包裝核酸序列的效率較低，導致只有一小部分病毒顆粒攜帶目標基因[2,3]。富集純化這些正確組裝的病毒顆粒是下游純化工作流程中的關鍵步驟，而金標準氯化銫（CsCl）密度梯度超速離心（DGUC）是最佳方法之一[4]。盡管使用CsCl-DGUC可輕松純化出純度大于95%的完整AAV顆粒，但線性梯度液在超速離心中的運行時間通常長達16小時或更久[5]，將總工藝時間延長至2-3天，限制了CsCl-DGUC的純化通量。

為應對這一耗時費力的挑戰，我們開發了基于OptiMATE密度梯度分液系統的自動化解決方案。該設備可自動將梯度液和大量樣品預先配置成線性梯度。鑒于形成線性梯度液的緩慢過程是制約DGUC運行時間的關鍵限制因素，預配置的線性梯度液能大幅縮短離心分離時間。而預配置梯度液的運行時間主要取決于樣品顆粒遷移及運行條件所引起的梯度曲線輕微變化。此外，OptiMATE還能消除梯度液制備中的人為因素影響，提升純化過程的一致性、準確性和易用性。

我們展示了在5個小時內自動化、高分辨率的純化完整AAV病毒顆粒的實驗流程。同時，也與16小時的傳統方法進行了關鍵質量屬性（CQAs）的對比。

方法

在本實驗中，使用了AAV純化中常用的13.5 mL和39 mL Ultra-Clear材質的快封管。

表1：自形成CsCl密度梯度 (手動) 和預形成CsCl密度梯度 (OptiMATE密度梯度液制備儀) 的離心參數

血清型AAV9通過三重轉染在HEK-293細胞中表達后，裂解細胞并離心，經親和層析初步富集所有衣殼種類，該粗純化材料作為實驗的AAV樣品。使用OptiMATE氯化銫溶液制備自形成和預形成CsCl密度梯度液，以AAV樣品作為稀釋劑（圖1）。在13.5 mL離心管加入5×1013病毒基因組（vgs）的AAV，在39 mL離心管加入1×1014 vgs的AAV。盡管預形成和自形成密度梯度的制備方法不同，但需確保每管使用等量的AAV。

我們將預形成密度梯度的超速離心時間設為5小時，因為我們預期這會產生更清晰（擴散更少）的條帶。實驗流程如圖1所示。離心后，通過側面穿刺提取AAV完整衣殼條帶，回收材料用1×PBS+0.01% Poloxamer 188進行緩沖液替換。使用Optima AUC在230 nm處的吸光度檢測回收樣品中完整衣殼的純度，以評估純化的質量。

圖1：AAV純化方案比較：(a) 自動配置預形成CsCl梯度液和 (b) 手動配置自成型CsCl梯度。在離心運行結束時AAV樣品被純化為可見條帶 (空衣殼-藍色；完整的衣殼（紅色），用注射器從管的側面刺穿并收集條帶

結果

自形成密度梯度離心管與預形成密度梯度離心管的條帶存在一點差異，尤其是部分包裝和完整衣殼條帶的擴散度（即清晰度），以及這些條帶與空衣殼條帶的分離度。然而，空衣殼條帶與完整衣殼條帶的分離度仍足以通過肉眼觀察和注射器穿刺提取回收。（結果如圖2和表2所示）

圖2：自形成密度梯度超速離心20小時后與預形成密度梯度超速離心5小時后代表性AAV條帶圖像，13.5mL離心管（左）和39mL離心管（右）

通過AUC檢查回收樣品的純度（圖3）。使用AUC分析得到的c (s) 圖通過積分來確定純化中完整衣殼的百分比。

圖3：預形成密度梯度（紅色）和自形成密度梯度（黑色）完整衣殼餾分組分的AUC數據的C (S) 圖顯示：在13.5 mL離心管（左）和39 mL離心管（右）中均無明顯的空衣殼鋒

我們觀察到相近的完整衣殼純化效率（預形成和自形成密度梯度均>90%完整衣殼），預形成密度梯度可在顯著更短的5小時超速離心時間內實現等效的完整衣殼純度，保守節省75%的時間。后續若通過進一步優化預形成密度梯度，可改善空衣殼、部分包裝衣殼和完整衣殼的視覺分離度。

表2：離心后回收AAV純度分析。13.5 mL離心管的誤差值（n=3），39 mL離心管（n=1）

結論

離心時間是OptiMATE通過自動配置線性梯度液解決的關鍵痛點之一。因為梯度液不再依賴重力形成，預形成梯度液可顯著縮短離心時間，實現更快且高效的材料純化。在本研究中，我們證明了使用OptiMAT可將2-3天的純化操作流程時間縮短至單日以內，在更短時間內實現等效的AAV純度回收，便于純化工藝的放大。此外，制備時間的減少最大限度地減少了人員的手動操作時間，顯著降低了操作誤差并提高了整體效率。

OptiMATE可實現真正的

自動密度梯度液分配：

• 連續密度梯度液分液（氯化銫）；

• 階梯梯度液的快速精確鋪設（碘克沙醇和蔗糖）；

• 30分鐘內完成所有分液及封管步驟（6管）；

• 分液過程完全由軟件程序自動控制，并可保存程序，簡化方法選擇；

• 自動熱封管封口，消除手動封管；

• 觸摸屏設計，友好的用戶交互界面；

• 所有管路支持無菌消毒，體積小巧可放置在生物安全柜內，實現無菌分液。

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