什么是自發熒光？自發熒光 (Autofluorescence, AF) 是指細胞內因存在的某些熒光成分和代謝產物在受到特定波長光激發時產生的固有熒光。常見的內源性熒光物質，如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH) 、氧化型黃素輔酶 (FMN/FAD) 、維生素以及含有芳香族氨基酸（如色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸）的蛋白質。

自發熒光（AF）干擾給流式細胞術的檢測帶來巨大的困擾，使熒光信號的檢測、定量和解釋更加復雜。同時，異質性的自發熒光在不同細胞類型和成分之間變化，使結果分析復雜性增加。

流式細胞術中AF的挑戰

雖然AF有助于評估細胞狀態，但其光譜干擾（尤其在400-600 nm區間）會掩蓋弱信號標記物（如FITC/Alexa Fluor 488），導致：

• 信號分辨率下降：巨噬細胞、死細胞等高AF細胞影響顯著；

• 動態波動干擾：細胞大小、代謝狀態、固定方法均會改變AF強度；

• 影響細胞類型結果特異性：髓系細胞（富含熒光顆粒）、抗原呈遞細胞（高線粒體含量）AF本底高。

圖1：細胞自發熒光差異示例

A. 植物細胞流式分析：由于不同細胞成分和色素導致的各個通道的AF差異，特別是葉綠素導致特定通道高AF（數據來源：都柏林大學學院（UCD）流式細胞技術核心主任Alfonso Blanco博士分享）

如圖1所示，在未染色的植物提取物中檢測到升高的自發熒光（AF）水平，提示后續實驗分析可能存在潛在的復雜性。實驗程序和染色技術，如醛固定和營養物質的供應，也會影響細胞的自發熒光水平，從而增加細胞分析中自發熒光的復雜性和變異性。

傳統的流式細胞術無法有效區分AF，業內的研究都把希望寄托在光譜流式細胞術，但此前的光譜流式細胞術也面臨諸多難題。

光譜流式細胞術中的AF難題

光譜流式細胞術通過捕捉每種熒光分子在廣泛波長范圍內的整個發射光譜，為其生成唯一的光譜特征，隨后用于特定光譜解混和識別。然而，光譜流式通過全光譜捕獲實現多色解混，但AF仍帶來三大挑戰（圖2）：

• 異質性AF干擾：不同細胞類型的AF光譜特征各異；

• 弱信號掩蔽：高AF背景淹沒低表達靶標信號；

• 光譜重疊：AF與熒光標記發射譜重疊導致假陽性。

圖2：AF在光譜流式中的典型干擾

A. 不同細胞的異質性AF信號；B. 高AF導致弱信號群體難識別；C. AF與目標熒光光譜重疊

如何應對這些挑戰和難題，需要全面了解樣本、精心設計實驗、嚴格的去混合技術以及適當的對照，以提高數據的準確性和可靠性。同時，使用多個通道區分自發熒光信號和特定的熒光染料至關重要，因此我們需要一臺功能更全面的科研利器的助力。

貝克曼庫爾特生命科學近期上市的??CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀可提供10個未染色通道，可從中提取不同群體的自發熒光特征，提升弱信號的檢測能力，幫助發現低豐度亞群。

下圖顯示了在CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀上評估了AF提取對白細胞群體譜解混的影響，并評估了使用多個AF特征是否進一步改善了解混。

針對不同細胞群體（中性粒細胞、嗜酸粒細胞、單核細胞、淋巴細胞）表面標志物表達的直方圖，在同一文件中考慮了0、1、2或4個自發熒光簽名在解混矩陣中的影響。紅色（No AF）表示沒有進行自發熒光提取的數據，藍色（1 AF）表示去除一個自發熒光簽名后的數據，橙色（2 AF）表示去除兩個自發熒光簽名后的數據，綠色（4 AF）表示去除四個自發熒光簽名后的數據。結果顯示，通過優化AF校正，減少了嗜酸細胞、單核細胞和淋巴細胞中假陽性CD16的情況，同時保留了真實的生物信號。

超越噪音：光譜流式細胞術

中自發熒光管理的策略

光譜流式方案

1對于簡單樣本：未染色的自發熒光細胞有獨特光譜指紋，可將其作內源性染料，設計檢測方案，計算去除自發熒光，能準確分析特定標記熒光，對識別低豐度標記、描繪其表達和亞群分布及提高陽性群體分辨率關鍵。

2對于異質性AF樣本：建立多類型AF光譜數據庫；采用多元未染色對照捕獲AF變異，建議使用多樣的未染色對照，能夠有效地考慮不同細胞類型所展現的自發熒光強度的固有變異性。??CytoFLEX mosaic光譜流式分析儀可提供多達10個未染色通道，可幫助異質性樣本建立更多元的光譜模型。

3靶標結合光譜變異：對像串聯聚合物染料這樣的熒光素，通過基于微球或細胞對照驗證實現最佳解析結果，排除自發熒光信號影響。

4通過門控分群、降維聚類等方法提升AF解析精度：先進的光譜去混合算法和適當的補償對照可以更好地將真實信號與噪聲隔離，從而顯著提高流式細胞術實驗的精度和可靠性。CytoFLEX mosaic??提供泊松混合 (Poisson hybrid) 算法，憑借更符合實際的統計模型、更精準的信號控制能力，以及更高的抗干擾能力，能夠有效地提高光譜流式細胞術的分析精度和數據質量。

CytoFLEX mosaic還提供了光譜拆分后的結果驗證功能，實時評估解析準確性。當數據出現異常時，儀器能自動提示潛在問題通道，讓研究人員輕松快速地排除數據隱患，保障實驗結果的可靠性。最后，光譜分析軟件CytExpert for Spectral，延續了CytExpert軟件智能易操作的特點，非常容易學習和操作。