本文由馬爾文帕納科粒度應(yīng)用專家劉曉華供稿

儀器：Zetasizer Ultra納米粒度電位儀

樣品池：使用小體石英樣品池(ZEN2112)測(cè)量樣品。使用MADLS測(cè)量顆粒濃度，可以得到粒徑大小分布和每個(gè)峰的濃度。測(cè)量時(shí)，需要用戶提供以下參數(shù)：

• 樣品材料：因?yàn)椴《疽職な怯傻鞍踪|(zhì)外殼制成，測(cè)量是以蛋白質(zhì)作為樣品材料。

• 分散劑材料：最初分散劑設(shè)置為水，但隨后通過(guò)編輯顆粒濃度結(jié)果來(lái)修正粘度以獲得正確的尺寸和濃度。測(cè)量粒度的準(zhǔn)確性對(duì)顆粒濃度的計(jì)算至關(guān)重要。緩沖液的粘度是用玻璃微珠來(lái)測(cè)量的^[1]。需注意，較大的顆粒散射更多，無(wú)需向樣品中大量添加。

• 緩沖散射計(jì)數(shù)率(背向散射角)：緩沖散射強(qiáng)度在用于測(cè)量的同一樣品池(ZEN2112)中測(cè)量，只需使用背向散射角設(shè)置單角度測(cè)量，并將測(cè)量位置設(shè)置在比色皿的中心。作為正常測(cè)量運(yùn)行，導(dǎo)出的計(jì)數(shù)率值用于“緩沖散射”領(lǐng)域的顆粒濃度測(cè)量。

三次重復(fù)測(cè)量的運(yùn)行時(shí)間小于4分鐘。

02丨測(cè)量結(jié)果

三種AAV樣品的粒徑大小分布如圖1，圖A至C所示。相應(yīng)的顆粒濃度如圖2，圖D至F所示。圖1，圖A所示的ATCC AAV2參考樣品含有聚集體，這并不奇怪，因?yàn)樵摌悠肥菑睦鋬鲋薪鈨龅模捎诳捎皿w積小，直接插入試管中，沒(méi)有任何預(yù)過(guò)濾。然而，盡管存在聚集體，基于MADLS技術(shù)測(cè)量的顆粒濃度給出了一個(gè)濃度值(1.12 x 10¹²顆粒/ml)與衣殼酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(0.92 × 10¹²粒/ml)相關(guān)良好。關(guān)于濃度更多細(xì)節(jié)見(jiàn)表1。對(duì)于Allergan的兩個(gè)AAV樣本，檢測(cè)到的聚集物少得多或?yàn)榱悖瑥谋?中可以看出，兩個(gè)樣本中病毒峰值的濃度值與衣殼ELISA結(jié)果具有良好的相關(guān)性。

圖1 三個(gè)樣品中的每一個(gè)的三次重復(fù)測(cè)量如圖所示：圖A-ATCC AAV2參考樣品，圖B-Allergan AAV樣品1和圖C-Allergan ADP樣品2

圖2 與圖1中相同的三個(gè)樣品的三次重復(fù)測(cè)量的分布顆粒濃度：圖D-ATCC AAV2參考樣品、圖E-Allergan AAV樣品1和F-Allergan ADP樣品2

為了比較變化，取每次重復(fù)測(cè)量的濃度結(jié)果，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和平均值，以此計(jì)算%CV。

表1 三個(gè)樣品的衣殼ELISA測(cè)定濃度數(shù)據(jù)和基于MADLS的顆粒濃度結(jié)果；ATCC AAV2參考樣品、過(guò)敏原樣品1、過(guò)敏原樣本。2、所有濃度均以顆粒/毫升為單位。n=表示在三次重復(fù)測(cè)量中，有幾次測(cè)到了峰值。如果不存在群體峰值，則標(biāo)注為n/a，即“不適用”。

比較表1的結(jié)果，ATCC AAV2參考樣本的病毒種群濃度值CV %最大。這是由于樣品中的聚集體影響了AAV峰值的確定程度。如果您將圖1A中的大小峰值可重復(fù)性與圖1B或1C中的其他病毒種群峰值進(jìn)行比較，您可以看到后者覆蓋得更好，可重復(fù)性更高。這將直接影響濃度測(cè)量的重復(fù)性。兩種Allergan AAV樣品的峰值重復(fù)性約為15%，樣品中沒(méi)有或只有少量聚集物。      

結(jié)論：

所提供的數(shù)據(jù)表明，Zetasizer Ultra基于MADLS的顆粒濃度既可以提供AAV病毒樣本的大小分布，從而報(bào)告樣本聚集狀態(tài)，也可以提供有關(guān)主要病毒群的濃度和存在的任何聚集的信息。每次重復(fù)測(cè)量不超過(guò)4分鐘，樣品可以在試管內(nèi)進(jìn)行整個(gè)測(cè)量，因此污染的風(fēng)險(xiǎn)最小，暴露給操作人員的風(fēng)險(xiǎn)也最小。

作為最后的注意事項(xiàng)，在測(cè)試期間，確定使用正確的樣品粘度以確保最準(zhǔn)確地測(cè)量顆粒濃度是很重要的。分散劑的粘度可以用粘度計(jì)測(cè)量，也可以在Zetasizer Ultra儀器中使用粒徑參考珠來(lái)測(cè)量^[1]。    

參考文獻(xiàn)：

[1] Determining Dispersant Viscosity Using Dynamic Light Scattering; Malvern Panalytical Application Note