關鍵詞：BSA、流動模式、高分辨率粒徑測試

傳統納米粒度儀基于動態光散射技術，使用一束激光照亮樣品，通過光電檢測器檢測懸浮在液體中顆粒的布朗運動造成的散射光的波動。原始的散射光光強隨時間的波動信號通過相關性計算得到體系的相關曲線，進而通過不同的數學模型，如累積法或者多指數法得到顆粒的粒徑和粒徑分布。納米粒度儀廣泛采用比色皿測試模式（文獻中常稱作batch mode），對于寬分布樣品的粒徑分布分辨率較低，且分布結果極度依賴于算法，極限分辨只能達到區分粒徑相差2.5-3倍的窄分布單獨組分，這極大地限制了粒徑分布結果的定量性。

動態流動模式通過與前端分離設備相連接使用，分別檢測每一個流出組分的粒徑，原則上講每一個流出組分都是單分散或接近單分散的，再通過濃度檢測器得到的信號，就得到了不依賴于算法的真實粒徑分布，其分辨率可以達到或者優于1.2倍粒徑分辨率。

在本應用中，我們將BeNano主機與SEC前端相連接，檢測了BSA的粒徑和粒徑分布信息。

原理和設備

采用丹東百特儀器有限公司的BeNano 180 Zeta Pro納米粒度及Zeta電位分析儀，儀器使用波長671 nm，功率50 mW激光器作為光源，在173°進行光散射信號收集。測試使用了27μL 低容量流通池作為樣品池。利用BFC-1信號采集器收集前端SEC設備的示差折光檢測器的輸出。

樣品制備和測試條件

在PBS緩沖溶液中，配置濃度為5mg/mL的BSA溶液，通過前端SEC（含有RI檢測器）進行進樣，分離。分離后的樣品組分逐一進入BeNano進行粒徑檢測。

測試結果和討論

圖1. BSA樣品光強、RI和粒徑流出曲線

由圖1中流出曲線可以看出，BSA流出曲線為多峰曲線。較早的流出峰（6分鐘左右）為團聚物峰，8-10分鐘為被分離的寡聚體峰。由于最后一個主峰為BSA的單體峰，可以依次推測出之前的峰分別為二聚體、三聚體和四聚體峰。主峰面積較大，說明大部分蛋白為單體。由粒徑流出曲線（紅點）可以看出，檢測到的粒徑從大到小逐漸流出，這與SEC分離的原理相一致！這既證明了前端SEC對于樣品分離效果良好，也證明了BeNano作為SEC的一個檢測器，有效得到了各個流出組分的粒徑信息。

圖2.BSA樣品柱狀光強分布曲線

圖3.BSA樣品光強分布曲線連線圖

圖2和圖3中，將色譜流出曲線轉化為粒徑光強分布曲線，可以通過曲線中看出明顯被分離的寡聚體粒徑，其中單體為7.16nm，這與BSA理論單體尺寸（~7nm）具有極好的符合度。其他組分的尺寸和面積列于表1中。

表1. BSA分布峰結果

圖4.單機模式BSA樣品光強分布曲線圖

圖5. 單機測試（連線圖）和流動模式測試（柱狀圖）粒徑光強分布曲線

通過圖4單機模式檢測的BSA溶液粒徑光強分布圖可以看出，單機模式下僅能分辨出兩個峰，通過圖5的BSA流動模式和單機模式檢測結果可以看出，流動模式可以將多個混合的組分分辨出來，極大的提升了粒徑測試的分辨率。其中在小粒徑峰內成功的辨認出粒徑差別極小的寡聚體組分。

結論

BeNano流動模式是將BeNano作為一個檢測器與前端分離裝置連用的測試模式，其目的是為了有效提升樣品粒徑測試的分辨率。在這個應用報告中，我們通過檢測BSA樣品，展示了BeNano流動模式的檢測能力，充分證明了其在高分辨率粒徑測試領域的發展潛力。